Wie kann man oder sollte man ...


einen Bilderstapel aufnehmen
  • Kamera in einer stabilen Position fixieren.
  • Am besten eine Kamera ohne Spiegelschlag nutzen (z.B. Canon Live View).
  • Als Regel sollte man die Auflösung der Kamera so wählen, dass man zweimal die Bild-Höhe und -Breite hat, die man später zeigen möchte. Das heißt: Nicht immer ist die höchstmögliche Auflösung die beste.
  • Den ASA-Wert sollte mein auf den kleinstmöglichen Wert (100 oder 200) stellen, um Rauschen zu verringern. Oft muss man dann länger belichten, was normalerweise beim Stacken kein Problem macht.
  • Die Blende des Kamera-Objektivs (und beim Mikroskop die Kondensorblende) sollte man möglichst weit öffnen um eine geringe Schärfentiefe zu erhalten. Das erlaubt beim Stacken eine bessere Höhendifferenzierung.
  • Bilder von oben nach unten (nah zu fern) aufnehmen, und zwar mit so feinen Fokusschritten, dass jedes Detail auf mindestens einem Bild scharf zu sehen ist. Hat man die Bilder in umgekehrter Reihenfolge aufgenommen, kann man das später mit PICOLAY korrigieren durch (Image list | Reverse order of images).
  • Möglichst den Stapel durch Annähern des Objekts und nicht durch Verstellen des Fokus' erzeugen. Ansonsten könnte es zu optischen Verzerrungen kommen.
  • Für Makro- und Auflicht-Aufnahmen ein homogene milde Beleuchtung einstellen (z.B. weißer Plastikbecher als Diffusor), um wandernde Schatten und Lichtspitzen zu vermeiden.
  • Bitte aufpassen, dass die Dateinamen der Bilder eines Stapels alphabetisch zur Fokusebene passen! Bilder wie img1, img2, img3.... img9, img10, img11 werden alphabetische sortiert zu img1, img10, img11, img2, img3. Man muss also bei den einstelligen Zahlen eine 0 einfügen: img01, img02, img03...
  • Wenn die Bilder durch eine Stereolupe (wo sich Fokussierachse und optische Achse unterscheiden) aufgenommen wurden oder das Objekt bzw. die Kamera sich im Stapel verschoben hat, muss man den Bilderstapel vor dem Stacking ausrichten.

Bilder zur Liste hinzufügen

Auf File | Add images klicken oder Strg-A drücken. Den Ordner mit dem gewünschten Bilderstapel auswählen (bitte zuvor jeden Stapel in einen eigenen Ordner kopieren). Dann Strg-A drücken, um alle Bilder auzuwählen, oder auf das erste Bild klicken, die Shift-Taste drücken und auf das letzte Bild des Stapels klicken. Durch Drücken der Strg-Taste und Klicken auf einzelne Dateinamen lassen sich einzelne Bilder auswählen oder abwählen. Dann 'Open' anklicken, die ausgewählten Bilder werden in die Liste aufgenommen und alphabetische sortiert. Das erste Bild wird links im Bildfenster angezeigt. Die neuen Bilder sind markiert erkennbar am [X]. Man kann die Markierung wechseln durch einen Doppelklick auf den Dateinamen in der Liste. Nur markierte Bilder werden beim Stacking und anderen Operationen verarbeitet.

Unter File | Image list finden sich verschiedene Möglichkeiten, Markierungen zu wechseln, markierte Bilder aus der Liste zu entfernen, oder sogar zu löschen.
die Stacking-Prozedur starten

Zunächst die Bilder in die Liste eintragen 'File | Add images' (oder Strg-A). Am einfachsten lässt sich die Stacking-Prozedur durch Drücken von Strg-F1 starten. Alternativ kann man auch 'Stack operations | Set stacking parameters | Go' anklicken. Dies startet das Stacking mit den aktuell eingestellten Parametern. Ein kleines Fenster zeigt den Fortschritt an (= Zahl der analysierten Bilder). Am Ende werden das gestackte Bild und die Tiefenkarte gespeichert (im selben Ordner wie die Bilder) und auch in die Liste geschrieben (unmarkiert). Die neuen Dateinamen beginnen mit 'p#' und enthalten die verwendeten Parameter, z.B. 'p#sharp_min1_en.jpg' or 'p#mapsharp_min1_en.jpg'. Dabei bedeutet 'sharp' gestacktes tiefenscharfes Bild, 'map' Tiefenkarte, 'min1', dass ein Minimum-Kontrast von 1 eingestellt war, und 'en' dass die automatische Bildverbesserung (Enhancement) genutzt wurde.
die perfekten Stacking-Parameter finden

Es gibt zahlreiche einstellbare Parameter, die man nutzen kann, um das perfekte Stacking-Ergebnis zu bekommen. Hier die kurze Einführung über deren Einfluss. Bitte Stacking operations | Set stacking parameters auswählen oder F2 drücken, um das Menue zu öffnen.
  • Minimum contrast = Minimum-Kontrast ist ein Rauschunterdrückungsfilter. Es hilft vermeiden, dass jedes Rauschen in den Bildern als Struktur interpretiert wird. Den Wert sollte man so weit erhöhen, dass alle tatsächlichen Strukturen noch erkannt werden, Rauschen jedoch geglättet wird (= Mittelwert aller Bilder des Stapels an diesen Stellen). Man erkennt die gemittelten Bereiche an der grauen Einfärbung auf der Tiefenkarte. Wenn man den Wert ändert und auf Go klickt, wird das neue Ergebnis nach wenigen Sekunden angezeigt, so dass man den optimalen Wert schnell finden kann.
  • Narrow or widen patches = Flicken verkleinern oder vergrößern. Dieser Menue-Punkt wird nur angezeigt, wenn als Minimum-Kontrast ein Wert >1 eingegeben wurde. Negative Werte dieses Parameters schmelzen die Ränder der farbigen Tiefenkarte ab und erzeugen ein knackigeres Ergebnis, während positive Werte die Flicken vergrößern und sanftere Übergänge in den Hintergrund erzeugen. Auch hier wird das neue Ergebnis nach Klicken auf Go nach wenigen Sekunden angezeigt.
  • Filter size = Filtergröße beschreibt die Strukturerkennungsmethode. PICOLAY erkennt Strukturen durch die Analyse von Gradienten zwischen benachbarten Pixeln (Bildpunkten). Für die Erkennung feiner Strukturen werden eng benachbarte Pixel verglichen, für große Strukturen weiter entfernte. Die Einstellung smart führt dazu, dass am Ende die Ergebnisse der Filter automatisch gemischt werden. Man kann aber auch manuell eine Filtergröße auswählen und nach Drücken von Go nach wenigen Sekunden das Ergebnis sehen. Schließlich könnte man die Ergebnisse der verschiedenen Filter durch 'Klonen' miteinander kombinieren.
  • Prefer high or low frames = untere oder obere Bilder im Stapel bevorzugen. Dies erlaubt es, die Sichtbarkeit verborgener Objektstrukturen zu verbessern. Gerade bei vielschichtigen Objekten ist das oft hilfreich. Die Bevorzugung der oberen Bilder verringert die Sichtbarkeit der tieferen Strukturen, welche andersherum durch Bevorzugung der unteren Bilder verbessert werden kann. Änderungen dieses Parameters erfordern einen neuen Durchlauf der Stacking-Routine. Eine andere Methode, die Darstellung mehrschichtiger Objekte zu verbessern, ist das Hologramm-Stacking
  • Auto-align images = Bilder automatisch ausrichten. Die Ausrichtung der Bilder vor dem Stacken ist manchmal nötig, um Strukturen im Bilderstapel an jeweils derselben Bildposition zu haben. Man sollte die Ausrichtung aber nur durchführen, wenn sie erforderlich ist, weil sie ansonsten die Qualität des Ergebnisses auch verschlechtern könnte. Hier mehr dazu....
  • Auto-enhance = Automatische Bildverbesserung. Hierdurch werden Schärfe, Kontrast und Farbsättigung im gestackten Bild leicht angehoben.
  • Test 4 param. sets = vier Parametereinstellungen testen. Hierdurch wird das Stacking mit verschiedenen Parameterkombinationen durchgeführt. Der Vergleich der Ergebnisse hilft dabei, die perfekten Stacking-Parameter zu finden.

einen Bilderstapel ausrichten

Gründe, die Bildausrichtung durchzuführen, sind:
  • Das Objekt hat sich bewegt.
  • Die Kamera hat gewackelt, sich gedreht o.ä.
  • Der Bilderstapel wurde durch eine Stereolupe aufgenommen, bei der bauartbedingt Fokussierachse und optische Achse nicht parallel sind.
Die Ausrichtungsroutine kann drei Parameter ändern:
  • Verschiebung in x- und y-Richtung. Diese Funktion ist immer aktiv.
  • Objektgröße ändern. Dies ist erforderlich bei Makro- und schwach vergrößernden Aufnahmen, wenn Strukturen je nach Annäherung unterschiedlich groß erscheinen, aufgrund der großen Schärfentiefe aber dabei nicht unscharf werden. Diese Funktion ist standardmäßig eingeschaltet, sollte aber (unter Options) deaktiviert werden für Mikrofotografien (>6.3x Objektive).
  • Rotationskorrektur. Wenn sich Objekt oder Kamera im Stapel gedreht haben, sollte man die Rotationskorrektur unter Options aktivieren.
Die Ausrichtung startet in der Mitte des Stapels und korrigiert die Bilder zunächst nach oben und später nach unten hin. Es werden neue Dateien ('xy#...") erzeugt, gespeichert und in der Bilderliste angezeigt.
Bilderstapel an einer konstanten Position betrachten

Nach dem Hinzufügen von Bildern in die Liste wird das erste Bild im linken Bilderfenster angezeigt. Um ein anderes anzuzeigen, klickt man auf dessen Namen. Man kann hinein- und hinaus-zoomen ([+] and [-] auf dem Bilderfenster). Dass ein Bild markiert ist, wird durch das '[X]' vor seinem Namen angezeigt. Zum Wechseln der Markierung kann man auf den Namen doppelklicken. Nur markierte Bilder werden für die verschiedenen Routinen verwendet. Hinweis: Alle Bilder sollten dieselben Dimensionen (Höhe und Breite) haben. Man kann die Liste durch 'Image list' | Reverse order umkehren. PICOLAY nimmt an, dass das erste markierte Bild die oberste Schicht zeigt. PICOLAY verändert die Original-Bilder nicht. Jedoch werden automatisch erzeugte Bilder ('p#...' etc.) ältere gleichnamige Dateien überschreiben. PICOLAY merkt sich das zuletzt benutzte Verzeichnis und nimmt dieses das nächste Mal als Start-Ordner.
Die meisten Bilder sind bei voller Auflösung größer als der Monitor. Die meisten Bildbetrachter springen an die linke obere Ecke neu angezeigter Bilder oder verkleinern sie auf Monitorgröße. PICOLAY jedoch merkt sich Zoomfaktor und Position für die Anzeige des nächsten Bildes. Dadurch kann man Veränderungen im Stapel an interessanten Positionen bei voller Auflösung betrachten.
einen Bilderstapel als Diashow anzeigen

Die markierten Bilder in der Liste lassen sich durch Image list | Start slide show oder Drücken von F12 als Diashow anzeigen. Anhalten kann man die Show durch erneutes Drücken von F12 oder durch Klicken in das (linke) Bilderfenster. Unter Options | Slide show features stell man ein wie lange (in millisec) jedes Bild angezeigt werden soll, und ob am Ende der Liste die Show rückwärts laufen oder wieder mit dem ersten Bild in der Liste anfangen soll. Um die Show in einer einzigen Datei zu speichern, kann man die Funktion Image list | Generate animated gif image nutzen.
animierte GIF-Bilder erzeugen

Die markierten Bilder der Liste (oder auch eine Diashow) kann in eine animierte gif-Bild transformiert werden durch Image list | Generate animated GIF image oder durch Drücken von Strg-G. Zuvor sollte man unter Options | Slide show features einstellen, wie lange (in millisec) jedes Bild angezeigt werden soll, und ob am Ende der Liste die Show rückwärts laufen oder wieder mit dem ersten Bild in der Liste anfangen soll. Man wird nach einem Namen für das File gefragt, welches im aktuellen Ordner gespeichert wird.
mpo-Dateien erzeugen

MPO (multi-picture object)-Dateien sind Container, die das linke und das rechte Bild einer Stereoansicht als jpg-Datei speichern. Dieses Bildformat kann durch einige bildverarbeitende Programme und 3D-Fernseher genutzt werden. Um ein mpo-File zu erzeugen, erstellt man zunächst mit PICOLAY die Ansicht für das linke und rechte Auge (als jpg), wozu man den [R]+[L] Modus bei der Erzeugung von 3D-Darstellungen 3D view nutzt. Die beiden Bilder müssen die ersten markierten Bilder in der Liste sein. Dann wählt man Image List | Generate MPO file, gibt einen Namen ein und klickt auf Go. Das MPO-File wird im aktuellen Ordner gespeichert.
mit sehr großen Bildern umgehen

PICOLAY hat manchmal Probleme mit sehr großen Bildern (>6000 x 4000 Pixels), bei denen ein 'Out of memory'-Fehler auftreten kann, auch wenn der Computer sehr viel RAM hat. Um dieses Problem zu vermeiden, kann man die Bilder vor dem Stacken verkleinern (Enhance ... Apply to all images... oder den relevantern Bereich vor dem Stacken ausschneiden (Crop selection ... Apply to all images.... Oft ist für ein gutes Stacking-Ergebnis eine genügend große Anzahl Bilder wichtiger als sehr viele Pixel pro Bild.
die Bildgröße ändern

Enhance-Unterprogramm auf dem linken Bildfenster aufrufen. Dort die Resize-Funktion nutzen. Aktivierung von 'Apply to all marked images' führt die Größenänderung bei allen markierten Bildern der Liste durch, die unter neuen Namen gespeichert werden.
Bildbereiche ausschneiden

Um Bilder zuzuschneiden, zeichnen Sie ein Rechteck in das Bild. Dann wählen Sie Edit | Crop selection ((für ein einzelnes Bild) oder Edit | Crop all marked images für alle markierten Bilder. PICOLAY erzeugt dann neue Dateien mit dem Namen 'Clip # .. "(+ ursprünglicher Name). Das Dateiformat der Bilder kann man unter Optionen einstellen Options | Save as.
Bilder umbenennen

Um Bilder umzubenennen, fügen Sie sie zu Ihrer Liste hinzu und achten darauf, dass sie markiert sind. Wählen Sie dann Image list | Rename marked files oder drücken Sie Strg-N. Tippen Sie die zu überschreibenden Zeichen in das linke und die neuen Zeichen in das rechte Feld und Go.
das Dateiformat von Bildern ändern

Um das Dateiformat der Bilder ändern, wählen Sie das neue Format unter Options | Save as. Fügen Sie die Bilder, um Ihre Liste und wählen Sie Enhance auf dem linken Bildfenster. Auf dem neuen Panel können Sie alle Änderungen deaktivieren oder einige aktivieren. Wählen Sie Apply to all marked images, um alle markierten Bilder zu ändern und Go.
ausgesuchte Bilddateien löschen

ACHTUNG: PICOLAY löscht Dateien vollständig und nicht in den Paierkorb!
Alle Dateien mit von PICOLAY generierten Namen (beginnend mit 'p#...' kann man durch Drücken von Strg-X oder Image list | Delete all p#-files, bzw. - nur für markierte Dateien - Delete marked p#-files löschen. Um andere Bilddateien zu löschen, markieren Sie sie in der Liste, wählen Sie Image list | Delete all marked files und bestätigen Sie die irreversible Löschung.
Bildparameter wie Helligkeit, Kontrast, Schärfe etc. ändern

PICOLAY ermöglicht die Änderung vieler Bildparameter mit Hilfe der Enhance-Funktion (auf dem linken) Bildfenster. Ein neues Fenster wird geöffnet, das es ermöglicht, über 20 Parameter anzupassen. Überprüfen Sie Ihre Einstellungen indem Sie auf Test klicken, bis Sie das perfekte Ergebnis sehen. Drücken Sie dann auf Apply. Wenn Sie alle markierten Bilder in der gleichen Art ändern wollen, aktivieren Sie zuvor Apply to all marked images.
auf ein Bild zeichnen

Die Maus-Werkzeug kann für unterschiedliche Funktionen auf dem linken Bildfenster verwendet werden. Wählen Sie zu Zeichnen [Mouse=] Paintbrush. Passen Sie die Pinselbreite Brush width an und wählen Sie die Farbe entweder durch Anklicken mit der RECHTEN Maustaste in das Bild oder Eingabe der RGB-Werte. Es gibt eine Wiederherstellungs-(Undo)-Funktion für einen Schritt. Sie können vorläufige oder das das Endergebnis mit einem neuen Namen speichern (Save with new name) oder das aktuelle Bild überschreiben Overwrite the current image (dessen Name wird angezeigt).
Bilddetails schärfen oder weichzeichnen

Wählen Sie [Mouse=] Sharpen oder [Mouse=] Blur und stellen Sie die Pinselbreite ein. Es gibt eine Undo-Funktion für einen Schritt. Es gibt eine Wiederherstellungs-(Undo)-Funktion für einen Schritt. Sie können vorläufige oder das das Endergebnis mit einem neuen Namen speichern (Save with new name) oder das aktuelle Bild überschreiben Overwrite the current image (dessen Name wird angezeigt).
innerhalb eines Bildes klonen (= Bildbereiche kopieren)

Wählen Sie [Mouse tool=] Clone within image und stellen Sie die Pinselbreite ein. Mit einem Klick der RECHTEN Maustaste in das Bild definieren Sie den Zielbereich, danach mit einem Linksklick den Quellbereich im Beld. Jetzt bewegen Sie die Maus mit gedrückter linken Taste, um von der Quelle zum Ziel zu klonen. Es gibt eine Wiederherstellungs-(Undo)-Funktion für einen Schritt. Sie können vorläufige oder das das Endergebnis mit einem neuen Namen speichern (Save with new name) oder das aktuelle Bild überschreiben Overwrite the current image (dessen Name wird angezeigt).
Bereiche aus Originalbildern in das gestackte Bild klonen

Wählen Sie [Mouse tool=]Edit | Clone to result image und stellen Sie die Pinselbreite ein. Jetzt bewegen Sie die Maus mit gedrückter linker Taste, um vom linken Bild in das rechte zu klonen. Verwenden der Funktion Synopsis (oben auf dem rechten Bild), um die gleichen Bereiche auf beiden Bilder anzuzeigen. Es gibt eine Undo-Funktion für einen Schritt. Wenn Sie das Bild speichern, erhält es es einen neuen Namen 'clone...'. Wenn Sie diese Funktion auf mit einem gestapelten Bild nutzen, wird auch die Tiefenkarte geklont, wobei die Schicht, aus der die Quellpixel stammen, eingetragen wird. Sie sollten beim Stacken die 'Auto-enhance'-Funktion deaktivieren, wenn Sie von den Originalen auf das gestapelte Bild klonen möchten, da ansonsten die Farben und Kontraste nicht perfekt übereinstimmen.
Text auf Bildern einfügen

Wählen Sie [Mouse tool=] Insert text, wählen Sie eine Schriftart, Größe und Farbe. Definieren Sie, ob der Text horizontal oder vertikal erscheinen soll, und geben Sie in den Text ein. Dann klicken Sie auf das linke Bild, um den Text zu platzieren. Es gibt eine Undo-Funktion für einen Schritt. Schließlich können Sie das Bild mit einem neuen Namen zu speichern 'p# ...'. Sie können auch auf alle markierten Bilder schreiben, wenn Sie diese Option aktivieren.
einen Maßstab einfügen

Wählen Sie [Mouse tool=] Draw scale bar, definieren sie Breite und Länge des Strichs und wählen Sie eine Farbe klicken Sie dann auf das linke Bild, um den Maßstab zu platzieren. Es gibt eine Undo-Funktion für einen Schritt. Schließlich können Sie das Bild mit einem neuen Namen zu speichern 'p# ...'. Sie können auch auf alle markierten Bilder zu schreiben, wenn Sie diese Option aktivieren.
Bilder mitteln

Verwenden Sie Stack operations | Average marked images oder F4, um den Mittelwert aller Bilder zu erhalten. Eine neue Datei 'p#mean ...' wird erstellt und der Liste hinzugefügt.
Bilder addieren oder voneinander abziehen

Achten Sie darauf, dass das Bild, das addiert oder subtrahiert werden soll, das erste markierte Bild in der Liste ist. Dann nutzen Sie Stack operations | Add or subtract 1st image oder F9, um die Routine zu starten. Neue Dateien 'p# .. "(+ alter Name) werden generiert und in die Liste aufgenommen.
Zwischenbilder in einen Stapel einfügen

Dazu verwenden Sie Stack operations | Insert intermediate images oder F5. Die neu erzeugten Dateien haben ein zusätzliches "i" im Namen. Bitte beachten Sie, dass es besser ist, mehr Originalbilder im Stapel zu haben als sie mit dieser Routine zu erzeugen, die zu einem glatteren Ergebnis führen könnte, aber keine neuen Informationen liefert.
farbbasiertes Stacking durchführen

Ein farbbasierte Stapelanalyse kann hilfreich sein, wenn man Strukturen mit einer bestimmten Zielfarbe (z.B. einen Fluoreszenzfarbstoff) lokalisieren möchte. Verwenden Sie dazu Stack operations | Colour-based stacking oder F3. Die Zielfarbe wird durch Klicken mit der rechten Maustaste in das Bildfenster oder durch Eingabe der RGB-Werte ausgewählt. Schwarz oder Weiß als Zielfarben könnten hilfreich sein, die dunkelsten und hellsten Strukturen oder Halos im Phasenkontrastaufnahmen usw. zu erkennen und loszuwerden.
die Bildhelligkeit im Stapel angleichen

Um Schwankungen der Bildhelligkeit zu kompensieren, verwenden Sie Stack operations | Auto-adjust brightness oder F7. Neue Dateien 'b# .. "(+ alter Name) werden generiert und in die Liste aufgenommen.
Weißabgleich für ein oder alle Bilder eines Stapels durchführen

Um den Weißabgleich der markierten Bilder im Stapel zu korrigieren, verwenden Sie Stack operations | Set white balance oder F8. Definieren Sie die Zielfarbe (eine Fläche, die so verändert werden sollte, dass sie grau bzw. weiß wird), indem Sie mit der RECHTEN Maustaste in das Bild klicken. Neue Dateien 'p# .. "(+ alter Name) werden generiert und in die Liste aufgenommen.
einen glatten Hintergrund (flat field) erreichen

Wenn Sie hot Spots auf dem Kamerachip, Schmutz in Ihrem Lichtweg oder einen störenden Helligkeitsverlauf haben, der in allen Bildern des Stacks auftritt, kann dies durch das PICOLAY-Flat-field-Verfahren korrigiert werden. Zuerst nehmen Sie ein Bild oberhalb und/oder unterhalb der Ebene, in der Ihr Objekt scharf abgebildet ist ist. Eventuell kann man auch den Mittelwert dieser unscharfen Bildern nehmen. Dann darauf achten, dass das unscharfe Bild als das erste Bild in der Liste markiert ist und mit Stack operations | Set background/flat-field or F10 die Routine aufrufen. Definieren Sie vor dem Start die Zielhintergrundfarbe, indem Sie mit der RECHTEN Maustaste in das Bild klicken. Neue Dateien 'p# ...' (+ alter Name) werden generiert und in die Liste aufgenommen.
RGB-Werte von Bildern durch die des ersten Bildes teilen

Hierzu Stack operations | Divide by 1st image or F11 and Go nutzen. Neue Dateien "div# .." (+ alter Name) werden generiert und in die Liste aufgenommen.
die Tiefenkarte eines Bilderstapels erzeugen

Eine Tiefenkarte wird automatisch während der Stapelroutine generiert. Sie wird gespeichert als 'p#map ...' (+ verwendete Parameter-Informationen) und in der Liste angezeigt. Die Tiefenkarte zeigt Farben von gelb (oben) über grün (Mitte) bis blau (unten). Grau zeigt Gebiete ohne erkannte Strukturen und ohne Tiefenlokalisierung. Die Karte kann verwendet werden, um Drehungen oder stereoskopische 3D-Bilder zu erzeugen. Die Tiefenkarte enthält keine Information über die absolute Höhe oder Dicke der Probe. Dieser Parameter (Länge der Z-Achse) muss definiert werden, wenn Sie eine 3D-Ansicht zu erzeugen.
korrekte 3D-Parameter einstellen

Wenn Sie ein scharfes Bild und eine Tiefenkarte (beispielsweise einfach durch Ausführen der Stapelroutine) erzeugt haben, klicken Sie auf 3D view (auf dem rechten Ergebnisfenster), um ein neues Panel mit den 3D-Parametern zu öffnen. Gleichzeitig die Tiefenkarte angezeigt. Hier eine kurze Zusammenfassung der einstellbaren Parameter und deren Auswirkungen:
  • Length of Z axis (% of image height) = Länge der Z-Achse (% der Bildhöhe). Dieser Parameter legt fest, wie flach oder dick Ihre Probe ist. Sie geben Sie keinen Wert in µm oder mm an, sondern vergleichen die Tiefe (Z-Achse) mit der Höhe (Y-Achse) des Bildes. Stellen Sie sich ein kugelförmiges Objekt vor - Ihre Bilder haben den gleichen Randabstand an allen Seiten (oben, unten, links, rechts) - dann ist "100" (%) der richtige Wert. Mit einem niedrigeren Wert würde die Kugel abgeflacht wie eine Linse aussehen, mit einem höheren Wert wie ein aufrecht positioniertes Ei. Selbstverständlich ist es möglich, den korrekten Wert auszurechnen, wenn Sie die Höhe ihres Objekts und die Fokusvorschübe Ihres Stapel kennen. Allerdings kann man vernünftige Werte durch Ausprobieren, wann das Präparat natürlich wirkt, leicht heraus finden.
  • Enlarge pixels = Pixelvergrößerung. Normalerweise hat ein Bilderstapel Tausende von Pixeln in X- und Y-Richtung, aber nur 20 bis 200 Schichten (= Pixel in Z-Richtung). Um nun bei der räumlichen Darstellung Risse, die aus diesem Grund entstehen könnten, vermeiden und um eine glatte Oberfläche zu erhalten, können Pixel in Z-Richtung vergrößert werden
  • Perspective = Perspektive. Durch die Nutzung dieses Parameters können dem Auge näher liegende Teile Ihres Objekts größer als weiter entfernte dargestellt werden. Es mag überraschend sein, aber Sie brauchen für 3D-Bilder diese perspektivische Verzerrung nicht. Es ist lediglich ein zusätzlicher Effekt bei sehr nahen Objekten.
  • Projection based on depth map = Projektion basierend auf der Tiefenkarte. Dies ist die normale 3D-Visualisierung. Jeder Bildpunkt des tiefenscharfen Bildes hat eine definierte Z-Position, die des Pixels mit der höchsten Schärfe im Stapel.
  • Hologram stacking. Wenn Sie ein transparentes mehrschichtiges Objekt (oft in lichtmikroskopischen Stacks) haben,könnte es Strukturen in verschiedenen Schichten geben, die beim der tiefenkarten-basierten Stacking verdeckt bleiben. Dann können Sie die Methode "Hologramm" verwenden, die nicht nur die schärfsten Pixel zeigt, sondern jedes Pixel, dessen Schärfe (Kontrastwert) ein einstellbare Schwelle überschreitet. Wenn Sie außerdem die Probe virtuell drehen, können solche internen oder Rückseitenstrukturen sichtbar werden.
  • Images to be generated = Bilder, die erzeugt werden soll. PICOLAY bietet eine ganze Reihe von Möglichkeiten für die 3D-Visualisierung oder Rotation.
    • Stereo Stereo bedeutet, dass zwei unterschiedliche Bilder erzeugt werden, die durch den Betrachtungswinkel der Augen leicht voneinander abweichen. Wenn Sie diese Funktion abschalten, werden Sie einzelne Bilder, die durch Rotation oder Animation dennoch einen räumlichen Eindruck machen können. Tatsächlich können viele Menschen nicht stereoskopisch mit beiden Augen sehen, haben jedoch gelernt, Bildveränderungen aufgrund von leichten Kopfbewegungen als Indikatoren für Entfernungen und 3D-Strukturen zu nutzen.
    • Viewing angle = Betrachtungswinkel. Wir sehen Objekte vor unserem Kopf mit gekreuzten Augen. Für nahe Objekte haben wir einen größeren Betrachtungswinkel als bei entfernteren. Entsprechend sollte man einen großen Blickwinkel (4 oder 5 °) für stereoskopische Bilder auf Ihrem Bildschirm einstellen, während ein kleiner Winkel (2 bis 2,5 °) korrekt für entfernte Videoprojektoren ist.
    • Relief. Mit dieser Funktion können Sie einen Schatten (Licht von links oben) hinzufügen und so den räumlichen Eindruck verstärken.
    • Distance = Entfernung. Mit Hilfe dieses Parameters kann man die scheinbare Entfernung eines 3D-Objekt einstellen und es vor oder hinter dem Bildschirm erscheinen lassen. Ein Wert von 0 stellt die Mitte des Stapels auf Bildschirm-Niveau. Negative Werte zeigen das Objekt in vor dem Bildschirm, während positive Werte es dahinter erscheinen lassen.
    • Red-cyan Rot-Cyan bewirkt, bewirkt die stereoskopische Darstellung des Objekts als Anaglyphenbild. Das Bild für das linke Auge wird rot dargestellt, das für das rechte Auge Cyan (= blauer + grüner-Kanal). Mein benötigt eine entsprechende Brille, um den 3D-Effekt zu sehen. Unser Gehirn legt die Farben übereinander, allerdings kann das Verfahren einige Farbveränderungen hervorrufen.
    • [RLR] and [LRL] erzeugt ein Panel mit drei Bildern nebeneinander. Dieses kann mit gekreuzten oder parallelen Augen betrachtet werden, und liefert sowohl eine konvexe als auch eine konkave stereoskopische Darstellung.
    • [R] + [L] erzeugt zwei getrennte Bilder für das linke und rechte Auge. Diese Bilder können für verschiedene Zwecke verwendet werden. Wenn Synopsis aktiviert wird (auf dem linken Bild) und die [R]- und [L]-Bilder in das linke und rechte Fenster geladen sind, kann man in die Bilder zoomen und eine stereoskopische Ansicht mit parallelen oder gekreuzten Augen genießen. Darüber hinaus könnte die Bilder für die Erzeugung von MPO-Dateien verwendet werden.
    • Rocking gif = Wackelbild, erzeugt ein animiertes GIF-Bild, das umschaltet zwischen der Ansicht für das linke und das rechte Auge.
    • [RL], [LR] or [RL]/[LR] sind weitere Kombinationen von Bildern für das linke und rechte Auge. Diese ermöglichen die Darstellung der beiden Bilder links neben rechts oder umgekehrt, als Viererpaket übereinander, zeilenweise verschachtelt (interlaced) oder als jps-Datei. Diese Formate können von verschiedenen Programmen und 3D-Fernsehern gelesen werden.
  • Background = Hintergrund. Hier kann man festlegen, ob Flächen ohne Strukturen (auf der Tiefenkarte graue Bereiche mit weniger als der gesetzte Minimum-Kontrast) als Durchschnittswert aller Bilder angezeigt werden sollen oder als eine einheitliche Farbe. Diese Farbe kann durch Klicken mit der RECHTEN Maustaste in das Bild auf der linken Seite oder durch Eingabe des RGB-Werts ausgewählen. Die Farbe hilft, das Objekt frei im Raum schweben zu lassen.
  • 3D rotation parameters = 3D-Rotationsparameter. Rotationen kann mit Einzelbildern oder mit jeder Art von stereoskopischen Ansichten durchgeführt werden. Oft geben aber nur kleine Rotationswinkel ansehnliche Ergebnisse
    • X, Y, Z definiert den Rotationswinkkel um die drei Achsen.
    • Stepwise rotation = schrittweise Drehung. Ermöglicht die Erzeugung von rotierenden Probenbilder um jede Achse. Die Ergebnisse können für Animationen aller Arte genutzt werden
    • Step Schrittgröße definiert den Winkelvorschub pro Schritt (eine reelle Zahl).
    • Repeats = Wiederholungen, definiert, wie viele Schritte berechnet werden sollen.

ein so genanntes 3D-Hologramm erzeugen, das verborgene Strukturen sichtbar macht

Das Stackingverfahren erkennt die schärfsten Strukturen in einem Bilderstapel, ohne andere Details mit niedrigeren Kontrastwerten zu visualisieren. Letztere gehen normalerweise in dem resultierenden Bild verloren. Bei einschichtigen Proben ist das kein Problem. Bei mehrschichtigen Objekten - oft bei mikroskopischen Analysen - verliert man wertvolle Informationen. Um dieses Problem zu überwinden, kann man mit PICOLAY das so genannte "Hologramm-Stacking" durchführen. Dafür muss man einen Mindestkontrastwert definieren, ab dem Details angezeigt werden sollen. Darüber hinaus ist es in der Regel empfohlen, das Objekt virtuell zu drehen, so dass die feinen Strukturen nicht unter den mit Maximum-Kontrat-Pixeln versteckt bleiben. Anschließend muss der Stapel erneut analysiert werden, um das "Hologramm" zu erzeugen.
  • Check Hologram stacking auf dem PICOLAY 3D-Panel anklicken.
  • Define Filter radius and Minimum contrast Filterradius und Mindestkontrast einstellen.
  • Export the layers = Schichten exportieren. Hierdurch kann mann die Schichten die den gesetzten Anforderungen entsprechen, als einzelne Dateien exportieren, z.B. wenn man sie in einem 3D-Drucker ausdrucken möchte.
  • Hologramm-Stacking kann man auch durchführen, um im Stapel nach einer Zielfarbe (Target colour) zu suchen, z.B. für die Analyse der Verteilung eines Farbstoffs im Bilderstapel.
  • Das Hologramm-Stacking wird gestartet durch einen Klick auf Go.

3D-Bilder aus einer Tiefenkarte und einem gestackten Bild erzeugen

Man kann 3D-Bilder auch aus einem zuvor gespeicherten Bild + der entsprechenden Tiefenkarte erzeugen. Fügen Sie ein Bild und die entsprechende Tiefenkarte der Bilderliste hinzu. Beide müssen die gleiche Größe haben und die gleiche Position zeigen. Klicken Sie auf die Karte, und definieren Sie sie als Tiefenkarte mit: Edit | Copy to depth map, in gleicher Weise das scharfe Bild in das Ergebnisfenster kopieren: Edit | Copy to result window. Klicken Sie nun auf 3D view auf dem (rechten) Ergebnis-Fenster und stellen Sie die gewünschten Parameter und das Anzeigeformat ein.
Stacking in mehreren Unterordnern gleichzeitig starten

Stellen Sie zunächst sicher, dass Sie geeignete Stackingparameter eingestellt haben. Dann wählen Sie File | Stack images in subfolders. Verwenden Sie Change folder (= Ordner wechseln), um den Ordner zu finden, der als Unterordner die Ordner enthält, die gestackt werden sollen. Wählen Sie nun alle Unterordner aus durch Toggle marks oder wählen einzelne mit einem Doppelklick aus. Drücken Sie Go, und warten Sie ... Wenn Sie auf die entsprechende Schaltfläche aktiviert (Turn off computer when done) haben, wird der Computer automatisch ausgeschaltet, wenn der Auftrag abgeschlossen ist.
Video-Stacking durchführen

Wie kann man Fokus-Stacking einer sich (langsam) bewegenden Amöbe oder einer Schnecke durchführen? Viele Kameras produzieren hochauflösende Videos, die verwendet werden können, um Video-Stacking im Makro- oder Mikromaßstab durchzuführen. Diese Technik kann auch für unbewegliche Objekte verwendet werden, da sie es ermöglicht, sehr feine Fokusschritte zu erhalten. Montieren Sie die Kamera in einer festen Position. Die Beleuchtung sollte ausreichend sein für 1/60 s Belichtungszeit. Nun nehmen Sie kurze Videos von 3 bis 5 Sekunden Sekunden auf, während Sie entweder den Fokusring der Kamera drehen oder das Objekt über den gesamten Tiefenbereich verschieben. Der nächste Schritt ist die Extraktion der Bilder aus dem Video. Dies kann mit Hilfe von Freeware-Programmen wie xmedia recode und virtualdub erfolgen. Schließlich wählen Sie die für den Stapel benötigten Bilder aus und führen die Stackingprozedur wie gewohnt durch.